贲门失弛缓症（AC）是由肠梗膜神经元逐渐变性引起的食道运动障碍。免疫介导的神经节炎被认为是肠脊髓神经元丢失的基础。使用scRNA-seq测量贲门失弛缓症中成对食管下括约肌（LES）组织和血液样本的免疫细胞转录谱。鉴定了扩增的免疫细胞模式和特定的转录表型，特别是在LES组织中。展示了C1QC+巨噬细胞和组织驻留记忆T细胞（TRM），特别是ZNF683 + CD8 + TRM和XCL1 + CD4 + TRM，在贲门失弛缓症LES组织中的肌丛周围显着扩增和定位。C1QC+巨噬细胞在转录上与中枢神经系统的小胶质细胞相似，并且在贲门失弛缓症中具有神经退行性功能障碍表型。TRM还表达贲门失弛缓症中免疫反应失调的转录本。此外，炎症随着疾病进展而增加，因为与II型贲门失弛缓症相比，免疫细胞在I型中更活跃。因此本文分析了免疫细胞转录景观，并将C1QC +巨噬细胞和TRM鉴定为贲门失弛缓症中与疾病相关的免疫细胞亚群。

Sc-RNAseq，scBCR，scTCR

1.贲门失弛缓症患者和对照组组织和血液中免疫细胞的单细胞转录组学

对9例贲门失弛缓症患者和4名组织和血液样本配对的对照组，以及2名仅具有外周血样本的贲门失弛缓症患者进行了scRNA-seq和TCR，BCR测序，获得了137,346个细胞的原始数据以进行进一步分析，包括71,450个外周血单核细胞（PBMC）和65,896个组织单细胞转录组。这些细胞每个细胞的中位数为1500个基因。通过scRNA-seq绘制了每个人的主要免疫细胞的景观。

2. 髓系细胞亚群的单细胞转录组学

通过对髓系细胞进行无监督的亚聚类，鉴定出11个簇，包括7个单核/巨噬细胞簇和3个树突状细胞( DCs )簇，以及1个肥大细胞(图2a , b)簇。基于经典标记，单核/巨噬细胞被鉴定为Macro1 ( C1QC + )，Macro2 ( CXCL3 + )，Macro3 ( FOShigh )，Macro4 ( CCL20 + )，Mono1 ( CD14 + S100A8高表达,为经典单核细胞)，Mono2 ( CD14 + ITGA4高、中单核细胞)和Mono3 ( FCGR3A [ CD16 ] + ,非经典单核细胞) (图2c , d )

3. 在贲门失弛缓症中，C1QC +巨噬细胞显著扩大并与多种神经退行性和行为障碍通路相关

与对照组相比，贲门失弛缓症中C1QC +巨噬细胞显著扩增。此外，多色IHC还证实C1QC +巨噬细胞在贲门失弛缓症中扩张并位于LES的肌间神经丛(以PGP9.5表示)周围或可能浸润(图3e )，提示其与肠神经系统( ENS )具有潜在的相关性。进一步的CyTOF分析显示，贲门失弛缓症患者LES中C1QC +巨噬细胞的比例有增加的趋势。C1QC +巨噬细胞中富集了多种代谢通路，尤其是氧化磷酸化，在c DC2中也高表达。此外，对LES整体组织质谱检测到的差异表达蛋白进行KEGG富集分析，证实了C1QC +巨噬细胞(图3h)的KEGG通路。C1QC +巨噬细胞在转录水平上与小胶质细胞相似，并在贲门失弛缓症中表现出神经退行性功能失调的表型。总的来说C1QC +巨噬细胞在贲门失弛缓症中显著扩增，并与多种神经退行性和行为障碍通路相关。

4. 贲门失弛缓症中克隆性扩增，但TCR组库的多样性降低

由于TRM在贲门失弛缓症中表现出失调的免疫反应，接下来探索了T细胞的TCR组库。发现组织中克隆扩增的TCR组库比血液中克隆扩增的TCR组库多，贲门失弛缓症中克隆扩增的TCR组库比对照(图4a)多。与TCR克隆性43呈正相关的Gini指数在贲门失弛缓症中显著高于对照组(图4b )。与TCR多样性43呈正相关的Shannon ' s熵指数在贲门失弛缓症中显著低于对照组(图4b )。这些结果表明贲门失弛缓症中T细胞的克隆性增殖明显，但TCR组库的多样性降低，与先前的研究一致

5. 贲门失弛缓症中B细胞无明显克隆性增殖，其特征是C1QC +巨噬细胞与TRM之间的相互作用发生改变

91 %的B细胞无明显克隆性增殖。具有3个以上BCR克隆的B细胞仅存在于贲门失弛缓症的血液中。表明B细胞在贲门失弛缓症中没有明显的克隆性增殖。此外，许多共抑制分子，包括PDCD1，HAVCR2，LAG3，ICOS，PRDM1和MAF，在TRM中显著下调(图5d )，支持了贲门失弛缓症中的活化细胞状态。GO和KEGG分析显示，TRM、GZMK + CD8 + T细胞和GNLY + CD8 + T细胞在多个功能类别中相互富集，包括T细胞活化、对干扰素- γ的反应、对肿瘤坏死因子的反应( GO分析)，以及Th1和Th2细胞分化、细胞粘附分子、多种免疫性疾病( KEGG分析) (图5e )。吞噬体和抗原加工递呈通路的高度富集可能是HLAs (图5d , e)高表达的结果，提示特异性T细胞活化。

在这项研究中，绘制了贲门失弛缓症和对照组外周血和配对LES组织中免疫细胞的单细胞图谱。鉴定了贲门失弛缓症中的免疫细胞和转录组。贲门失弛缓症的LES组织中富集C1QC +巨噬细胞和TRM，尤其在LES的肌间丛周围甚至浸润。通过多组学分析发现贲门失弛缓症患者和对照组单个免疫细胞的转录图谱显示了疾病特异性的免疫细胞组成和转录表型，尤其是LES组织中的免疫细胞，可能参与了贲门失弛缓症的炎症过程。C1QC +巨噬细胞和TRM在贲门失弛缓症的LES组织中显著扩张并定位于肌间神经丛周围。C1QC +巨噬细胞在转录水平上与CNS的小胶质细胞相似，并表现出神经退行性功能障碍的表型。TRM还表达了贲门失弛缓症中失调的免疫反应的转录本。通过潜在的相互作用，C1QC +巨噬细胞和TRM可能会导致神经节炎和肌间神经元的丢失。肌间神经元的丢失可导致食管蠕动异常，食管扩张，LES松弛功能受损，最终导致贲门失弛缓症的发生。

参考文献：

Liu ZQ, Dai H, Yao L, Chen WF, Wang Y, Ma LY, Li XQ, Lin SL, He MJ, Gao PT, Liu XY, Xu JX, Xu XY, Wang KH, Wang L, Chen L, Zhou PH, Li QL. A single-cell transcriptional landscape of immune cells shows disease-specific changes of T cell and macrophage populations in human achalasia. Nat Commun. 2023 Aug 4;14(1):4685. doi: 10.1038/s41467-023-39750-5. PMID: 37542039; PMCID: PMC10403544.