WS主要由WFS1的致病变异引起，Wolfram基因(WFS1)编码一种在内质网膜上具有9个跨膜结构域的蛋白，该蛋白在胰岛β细胞和大脑中高度表达。对WS患者胰腺的分析表明，胰岛β细胞存在选择性损失。位于内质网膜上的WFS1在蛋白质从内质网转运到高尔基体中起作用，它直接与包括胰岛素原在内的一系列囊状货物蛋白相互作用。WFS1缺陷小鼠在葡萄糖刺激下表现出胰岛素加工减少和胰岛素分泌受损。胰岛β细胞中WFS1的功能丧失导致胰岛β细胞死亡后内质网应激增加和未折叠蛋白反应(UPR)的激活。这些发现表明WFS1缺陷胰岛β细胞的细胞应激增加。异常应激颗粒的形成在多种疾病中起着关键作用，真核起始因子2 (eIF2)在α亚基上的磷酸化可通过包括PERK在内的四种不同的激酶启动ISR，从而诱导应激下UPR的激活。一旦ISR被触发，限制了AUG启动的mRNA翻译，诱导应激颗粒的组装和细胞死亡。因此WFS1可能控制ISR和随之而来的应激颗粒形成。

由于缺乏适当的人体模型，对WS发病机制的了解受到限制。为了阐明WFS1缺乏导致胰岛β细胞衰竭的机制，通过hESCs衍生的胰岛来表征WFS1缺乏作为人胰岛β细胞衰竭模型。结果表明，WFS1缺陷驱动胰岛β细胞命运进入应激轨道，导致功能失败。使用ISR抑制剂ISRIB治疗可增加胰岛的比例并减轻细胞凋亡。研究为WS糖尿病胰岛β细胞紊乱提供了机制见解，并提出了一种潜在的ISRIB治疗方法。

scRNA-seq；胰岛β细胞；Wolfram syndrome

我们利用含有WFS1缺陷的sc -胰岛作为体外逐步分化hESCs分化的疾病模型（图1A），同时，利用CRISPR/Cas9敲除策略建立了WFS1敲除hESCs报告细胞系(WFS1−/−)。采用qRT-PCR检测ES期到胰岛期WFS1的表达水平，我们发现WFS1在WT细胞系的分化过程中逐渐表达，这与报道的WFS1在人原代胰岛β细胞中的高表达一致（图1B）。对WT和WFS1−/−胰岛进行scRNA-seq分析（图1C）。WFS1−/−胰岛中WFS1的表达大大减少，证实了WFS1的完全敲除（图1D）。无监督聚类分析确定了WT和WFS1−/−中8个不同cluster（图1E），包括β细胞(表达INS、PCSK1和G6PC2)、α细胞(表达GCG)、δ细胞(表达SST)、ε细胞(表达GHRL)、胰腺祖细胞(表达SOX9)、增殖细胞(表达MKI67)、EC细胞(表达FEV)和多激素内分泌细胞(共表达GCG和INS)（图1F）。

2. 拟时序分析揭示了应激和成熟的β细胞亚群

为了研究WFS1在胰岛β细胞异质性中的功能，将所有合并的胰岛β细胞重新聚类为两个主要的β细胞亚群（图2A）。我们根据top上调基因鉴定了这两个亚群，并将其定义为成熟β细胞和应激β细胞。成熟β细胞的特点是高表达成熟胰岛β细胞标志物，如INS、CHGA、G6PC2和PCSK1，而应激β细胞则高表达应激相关标志物，如XBP1、ATF4、ATF6、DDIT3、HERPUD1、EIF2AK1、EIF2AK2和EIF2AK4（图2B）。我们共同揭示了成熟β细胞和应激β细胞两个亚群的异质性。此外，通过使用Monocle拟时序分析在胰岛β细胞中发现了两个不同的分支（图2C）。通过分子动力学来区分这两个分支，基因表达动态分析主要集中在前500个差异表达基因上（图2E）。我们发现，应激相关标记在1分支上高表达，如ATF4和JUN，而胰岛β细胞身份和成熟标记在2分支上高表达，如INS、INS- igf2、CHGA和CDKN1C。基于以上特征，我们推断1分支为应激状态，2分支为成熟状态(图2C)。胰岛β细胞总分支为两种终末分化的细胞类型。大多数应激β细胞位于1分支(应激分支)的末端，与应激β细胞群一致(图2D)。同时，我们评估了两个命运分支中与胰岛β细胞标志物和应激相关标志物相关的基因表达模式。WFS1沿成熟分支高表达，表明WFS1的功能与β细胞成熟相关。而ATF4、G3BP1和ATF6的表达沿胁迫分支升高，但沿成熟分支明显降低(图2F)。总之，通过单细胞转录组学分析，胰岛β细胞的组成被鉴定为两个不同的亚群，包括成熟和应激β细胞，具有两种不同的命运轨迹。

3. WFS 1缺乏导致β细胞进入功能成熟缺乏的应激分支

值得注意的是，WFS1−/−胰岛β细胞主要处于应激状态。分支沿拟时序向成熟分支方向停滞（图3A）。接下来，我们评估了WT和WFS1−/−胰岛β细胞在三个细胞命运分支中的比例(图3B)。WT和WFS1−/−胰岛β细胞分别占分支前细胞总数的58.6%和41.4%。在成熟分支中，WT细胞的比例达到86.5%，而在应激分支中，WFS1−/−细胞的比例占总细胞的92.3%(图3B)，这与WFS1−/−SCislet β细胞向成熟分支的停滞轨迹一致。同时，我们对WT和WFS1−/−胰岛β细胞的转录组学变化进行了更深入的分析，以检测分子变化。其中有2701个上调基因和446个下调基因(图3C)。与胰腺β细胞成熟和功能相关的基因，如INS、NKX6.1、PCSK1和CDKN1C在WFS1−/−胰岛β细胞中下调，细胞应激相关基因如ATF4、JUN、ROCK2和HSP90B1在WFS1−/−sc -胰岛β细胞中上调(图3C，3D)。相比之下，我们对scRNA-seq数据的分析显示，WFS1−/−胰岛β细胞表现出缺乏成熟的应激细胞命运。为了验证这一点，我们在两种细胞中进行了GSIS实验。葡萄糖刺激后与WT相比，WFS1−/−胰岛素分泌明显减少(图3E, F)。并且在WFS1−/−胰岛中测量每个细胞的胰岛素含量，结果显示与WT sc -胰岛相比，细胞内胰岛素含量显著降低(图3E, G)。我们的结果表明，WFS1是促进β细胞走向成熟轨迹所必需的。

4. WFS 1缺乏诱导β细胞中的ISC

为了确定调节WFS1−/−胰岛β细胞功能衰竭的信号通路，对胰岛β细胞进行了GSEA分析，并确定了富集程度最高的通路。在WFS1−/−胰岛β细胞中，与细胞应激反应相关的如PERK和HSP90在通路富集分析的前25条上调通路中显著富集(图4A)。为了进一步验证WFS1−/−胰岛β细胞中的下调翻译，我们比较了eIF2相关基因的表达。WFS1−/−胰岛β细胞内的差异基因中有54个与eIF2信号通路相关被富集(图4B)。eIF2信号通路相关基因相对表达变化对比热图显示，75%基因下调，表明ISR激活(图4C)。当翻译起始被应激反应抑制时，就会形成应力颗粒。WFS1−/−胰岛β细胞内的差异基因中有21个与核心应激颗粒基因相关被富集(图4B)。值得注意的是，21个与核心胁迫颗粒基因相关的基因，其中包括所有7个被描述为胁迫颗粒组装“必需”的基因(图4D)。综上所述，我们的结果表明，WFS1缺失激活胰岛β细胞的ISR，并导致翻译的整体衰减。为了进一步验证ISR在WFS1−/−胰岛β细胞中的激活作用，我们检测了ISR相关基因的表达。与WT相比，WFS1−/−胰岛β细胞中ISR相关基因的表达高度增加(图4E)。通过WB检测PERK/eIF2信号通路关键因子的表达水平，发现与WT相比，WFS1−/−胰岛β细胞中eIF2α的磷酸化水平显著升高，PERK和ATF4蛋白水平也显著升高(图4F，G)。同时，我们采用免疫印记法检测应激颗粒中必需成分G3BP1的表达。与WT相比，WFS1−/−胰岛β细胞应激颗粒平均强度显著升高(图4H，I)。

5. ISR抑制剂逆转胰腺β细胞衰竭

为了研究抑制ISR是否可以用于治疗WS的胰腺β细胞衰竭，使用ISR抑制剂ISRIB在细胞水平进行验证(图5A)。与对照相比，经ISRIB处理的WFS1缺陷胰岛中G3BP1的平均强度显著降低(图5B，C)。由于活化的ISR抑制蛋白合成，我们通过OPP标记进行新生多肽合成试验，以评估总蛋白合成。结果经ISRIB处理的WFS1缺陷胰岛中减少的总蛋白合成显著恢复(图5D，E)。此外，我们发现，与对照相比，经ISRIB处理的WFS1−/−胰岛中INSGFP NKX6.1-mCherry双阳性胰岛β细胞的比例显著增加(图5F，G)。接下来用100 nM ISRIB或对照治疗WFS1缺陷胰岛2天(图5H)。与对照物相比，经ISRIB处理的胰岛中G3BP1的平均强度显著降低，表明应激颗粒的形成减少(图5I，J)。与此同时，经ISRIB处理的WFS1缺陷胰岛中总蛋白合成也得到恢复(图5K，L)。同时经ISRIB处理的胰岛β细胞凋亡显著减少(图5M）。这些结果表明，抑制ISR能逆转胰腺β细胞损失。

6. ISR抑制剂改善WFS1胰腺条件敲除小鼠的葡萄糖稳态

为了验证ISRIB在体内的有效性，我们将WFS1-flox小鼠与Pdx1-Cre小鼠杂交，产生胰腺WFS1条敲小鼠，腹腔注射给药2.5 mg/kg ISRIB或对照物(图6A)。我们观察到，在8周龄时，与对照组相比，接受ISRIB治疗的WFS1缺陷小鼠的空腹血糖水平显著降低(图6B)。对小鼠胰腺进行了胰岛素免疫染色。我们发现，与对照组相比，ISRIB处理的CKO小鼠胰腺β细胞的胰岛素强度和胰岛素含量显著恢复，与WT小鼠相似(图6C-E)。OPP标记显示，ISRIB治疗显著恢复了CKO小鼠受损的总蛋白合成，并减少了应激颗粒的形成(图6F-H)。此外，腹腔内糖耐量试验显示，与给药小鼠相比，ISRIB治疗显著改善了CKO小鼠的糖耐量(图6I，J)。同时，我们在体内用GSIS检测胰岛素分泌，与对照组相比，经ISRIB处理的CKO小鼠在高糖刺激下胰岛素分泌明显改善(图6K)。值得注意的是，WT和ISRIB处理的CKO小鼠在高糖刺激下的胰岛素分泌没有显著差异(图6K)。这些结果表明，ISRIB可以逆转β细胞衰竭，改善体内葡萄糖稳态。总的来说，ISRIB可用于治疗WS糖尿病的胰腺β细胞衰竭和功能(图6L)。

Wolfram综合征是一种罕见的常染色体隐性遗传病，许多患者过早死亡。然而，由于缺乏合适的人类模型，Wolfram综合症的致病机制尚不明确，导致目前尚无治疗方法可延缓、停止或逆转Wolfram综合征的发展，因此迫切需要新的Wolfram综合症模型进行深度探索。研究人员利用Wolfram综合症体外和体内模型，揭示了ISRIB在缓解胰岛β细胞功能衰竭中所发挥的作用，为Wolfram综合症的治疗提供了新思路。利用单细胞转录组测序技术研究了致病基因WFS1对胰岛β细胞的影响，并发现ISR抑制剂ISRIB能缓解WFS1缺失的胰岛β细胞的功能衰竭，且在WFS1条件性敲除小鼠中也能发挥作用。此研究为治疗WS糖尿病提供了新的药物选项。华大智造DNBelab C系列单细胞建库平台为该研究提供了单细胞测序支持。