RT-PCR实验必需用品

实验操作Protocol

RT反应

注：*实验样品RNA体积根据浓度确定，总量小于等于1μg总RNA；当实验样品RNA的表达数量较少时，可加至5.5μl，同时在反应体系中相应地减少RNase free H2O 的量。

b、按以下条件进行逆转录反应

注： ** 对于随机六聚体引物，在室温温育10 分钟后，再进行逆转录反应。

     *** 对于有复杂二级结构的RNA 模板，逆转录温度可适当提高，不可高于60℃；也 

     可以加模板和引物后70℃ 温育10 分钟，再冰浴5min 后继续后续实验；逆转录长链 

     RNA（> 2kb）时，建议在42℃左右进行。

     **** 95℃加热使AMV Reverse Transcriptase失活并阻止其与DNA结合。

使用提示

1.  RNA模板可以采用总RNA或mRNA。

2.  RT实验应避免RNase污染，可采用以下措施： 

  1）  因人的皮肤表面和唾液都有RNase，因此实验中应戴一次性手套和口罩；

  2）  RT实验应使用专门的仪器和耗材，建议在专门区域操作RNA；

  3）  RT实验相关耗材应使用干热灭菌（180℃，60分钟）或用0.1％DEPC(焦碳

酸二乙酯)水溶液在37℃处理12小时后在121℃高压灭菌30分钟；

3.  AMV逆转录酶和RNase抑制剂在取用之前应离心后再吸取，吸取时动作要 

慢，使用后应尽快放回-20℃； 

4.  dNTP应避免反复冻融以免失效； 

5.  引物的选择可根据具体情况，Oligo-dT适用于具有PolyA尾的RNA(一般是

真核生物的mRNA)，Random Hexamer Primer适用于所有RNA，尤其适用于 

有复杂二级结构的RNA，特异性引物适用于已知模板序列的RNA； 

6.  PCR反应中MgCl2浓度可依据不同条件进行调整，当目的片段长度大于2kb  

时，我们建议增加MgCl2浓度，以0.5mM间隔梯度增加。