摘要：
提取小鼠肌肉dna所使用的四种均质法进行对比。1.手动液氮研磨（研钵和杵），2.opsd的cryogrinder液氮研磨，3.转子定子研磨，4.ht homogenizer 高通量组织研磨机。用上述四种方法对dna产率，纯度和片段大小的参数进行比较。转子－定子匀浆器产生的最小的片段，而cryogrinder产生最大的dna片段，ht homogenizer的dna产量最高，而传统的液态氮冷冻手动研钵研磨dna产量最少。ht homogenizer珠磨式产生最高纯度的样品，转子-定子提取的dna纯度最低。
简介：
样品破碎是rna，dna和蛋白质分离的早期必要步骤，分为物理破碎和化学破碎。化学方法通常依赖于去除剂（detergents）和离液剂（chaotropes）；物理法则包括混合研磨机（磁珠搅拌器）、超声、研钵和杵、及手持式均质器（转子-定子法）。
虽然化学裂解往往是最有效的方法，但它破坏固体组织并不总是完全可靠。机械破碎的两种常用方法是通过使用转子-定子，它涉及剪切或切割，并通过珠磨仪或研钵和杵进行二次粉碎。
转子-定子用于快速剪切样品。它实质上是一个圆形的剪刀，非常类似手持式均质器。转子-定子是均质样本的典型工具。ht高通量组织研磨机，用于单个样品或高通量应用。8字形的运行方式已被往复直线运动取代。研钵和杵是用于磨样的历史性的工具。它可有效分离样品dna和rna。cryogrinder™作为代替研钵的最小型研磨器，可用于研磨非常微量的样品（100毫克左右）。
本文用市售的试剂盒在四种研磨方式中进行比较。
材料和方法
组织样品：雌性cd1小鼠42天（charles river实验室），使用和提取的腿部肌肉，冷冻，并贮存于-140℃下。均质化，组织解冻，如下所述进行处理。
组织dna纯化：小鼠肌肉（25毫克），使用qiaamp dna mini试剂盒。
小鼠肌肉组织用cryogrinder冷冻均质或研钵与杵液氮处理后转移到溶液中。
而rotor-stator转子-定子 和 ht homogenizer 高通量组织研磨机的样品则直接在缓冲液中匀浆。在这两种情况下，随后加入sds和蛋白酶k。
纯化的dna在260和280nm处通过分光光度法进行分析，以测量浓度和纯度。琼脂糖凝胶电泳（在1x tae缓冲液的1％琼脂糖）被用来评估分离的dna的片段大小。dna样本电泳前用20x酒精沉淀。
均质化方法：用液氮冷却的研钵和杵（coors）； cryogrinder液氮冷冻研磨器（opsd）；转子-定子均质器（virtis）；ht homogenizer高通量组织研磨机（opsd）进行。如下：
表1.均质化小鼠肌肉组织的方法
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研钵和杵（手动） |
样品（25mg），用液氮冷冻，置于低温冷冻150mm研钵中，用冷却的研杵手动粉碎。粉碎的肌肉被转移到一个冷却的2ml离心管中，并悬浮于裂解溶液中。 |
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cryogrinder™ (电动研钵和杵) （opsd） |
样品（25mg）从制冷机（盛放液氮的装置）取出后放入预冷cryogrinder钵体，慢慢调试至合适的速度后粉碎样品，后转移到一个冷却的2ml离心管中，并悬浮于裂解溶液中。 |
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ht高通量组织研磨机（opsd） |
样品（25mg）置于96孔板中，含1个4mm不锈钢研磨球，加缓冲液，1200转2min。将裂解物转移到2ml的离心管中。 |
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rotor-stator （virtis） |
样品（25mg）加入缓冲液以10k转速，6mm的直径，4毫升离心管匀浆2分钟（virtis）。将裂解物转移至2 ml离心管中 |
结果
表2.光密度，比率，纯化的dna产量
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260 nm |
280 nm |
ratio |
dna yield (μg) |
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ht homogenizer |
1.50 |
0.85 |
1.77 |
30.1 |
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rotor-stator |
0.71 |
0.55 |
1.29 |
14.2 |
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mortar and pestle研钵和杵 |
0.20 |
0.14 |
1.41 |
4.0 |
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cryogrinder |
0.46 |
0.29 |
1.60 |
9.2 |
样品均质化的方法影响dna产量，纯度和片段大小。
dna产量：ht homogenizer高通量组织研磨机提取的dna产量最高，随后是转子-定子和cryogrinder，而研钵和杵的dna产率最低。
dna纯度：ht homogenizer高通量组织研磨机的260/280比率表明其纯度最高，cryogrinder也有较高的纯度，其次是研钵和杵，转子-定子纯度最低。
片段大小：片段大小受均质化方法的影响显着，转子-定子剪切法从约15kb处产生连续片段（图1），ht homogenizer高通量组织研磨机产生比转子-定子更窄的大片段范围，cryogrinder产生了比其他方法更宽范围的大片段。除了片段大小之外，在对应于ht homogenizer高通量组织研磨机，转子-定子和cryogrinder的样品的孔中存在显着的荧光（较大分子量的分子片段）。
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figure 1. purified dna analyzed on 1% agarose gel (1x tae) with lambda-hindiii size markers. lane 1 - lambda hindiii digest lane 2 - ht homogenizer lane 3 - rotor-stator lane 4 - mortar and pestle lane 5 - cryogrinder lane 6 - lambda hindiii digest |
讨论
一、根据不同均质化方法对dna产量，片段大小和纯度影响，得出结果：
1. ht homogenizer高通量组织研磨机的dna产量最高，纯度最佳。
2. cryogrinder低温研磨产生了大片段dna，但产量和纯度较低。
3. 转子-定子具有良好的产率，但纯度很低，片段最小。
4. 研钵和杵具有良好的dna片段，但dna纯度相对较低，产量很低。
简言之，没有一个方法可达到dna的产量最高，纯度最高，和片段最佳。
二、dna片段大小作为均质化的直接后果效果显著
1. 转子-定子依赖于旋转刀剪切组织产生相对较小dna片段。
2. cryogrinder冷冻研磨器，通过粉碎和研磨，产生的相对大的dna片段。
3. ht homogenizer高通量组织研磨机和cryogrinder冷冻研磨器的粉碎显然比转子-定子剪切对dna的有害影响更小。
4. 在微量样品中，研钵研磨难以收集粉碎样品，得到 dna产量非常少。研钵和杵的这个产量问题是开发cryogrinder冷冻研磨器的最佳理由。
5. cryogrinder冷冻研磨器具有微型砂钵（约1/2英寸直径），阻止粉碎样品的扩散，并在研磨后得到有效的回收样品。
三、不管来源如何，重要的是注意内在或外在因素会影响dna的最终纯度
由不同均质方式产生的不同程度的样品纯度难以解释（表2）。 匀浆后，所有样品都加sds、蛋白酶k，然后用qiaamp dna mini kit纯化。该试剂盒旨在去除杂质，结果基于260/280比为1.29至1.77。可能是，转子-定子、研钵和杵引入来自样品外的污染物。而ht homogenizer高通量组织研磨机使用消耗性的试管和钢珠，可避免污染。
四、根据应用，每种破碎方式都具有价值
对于微量样品，cryogrinder冷冻研磨器产生较大的片段和良好的产量。
而ht homogenizer高通量组织研磨机通过撞击可产生最大片段dna，通量高是ht homogenizer高通量组织研磨机的最大优势。
五、越来越多的场合需要处理低温保存的细胞和生物样品
温度敏感的样品（如原代和培养的细胞，蛋白质、rna）等如果加热或解冻，会丧失生物活性。为了解决这个问题，opsd设计了cryocooler™，这是保存培养细胞和组织标本冷冻小瓶完整性的有价值的工具。这种便携式低温工作站可以与cryogrinder研钵和杵系统配对，以在低温下研磨样品并储存运输样品。
如需了解更多ht homogenizer高通量组织研磨机及cryogrindertm低温冷冻研磨器的信息，请参考我司展台与我们联系。